Gen GPR54 jako regulator okresu dojrzewania czesc 4

Ukierunkowana delecja w locus Gpr54 u myszy. Panel A pokazuje schematyczną reprezentację allelu Gpr54, który był celem delecji (panel A). Niebieskie pola reprezentują eksony, a purpurowe pola – kasety oporowe i markery. Główne miejsca restrykcyjne, primery i sondy są pokazane powyżej loci. Panel B pokazuje prawidłowe ukierunkowanie ramion 5 i 3 , co wykazano metodą Southern blotting. Strzałki wskazują prążki zmutowane i typu dzikiego wykryte przez diagnostyczne trawienie restrykcyjne i sondowanie. Rozmiary podane są w liczbach par zasad. Southern blot przedstawia oczekiwany wzór u myszy heterozygotycznych, typu dzikiego i zmutowanych. U myszy, które są homozygotyczne pod względem delecji Gpr54 (panel C), usunięto transkrypcję 3 locus. Analiza RT-PCR odcinka obejmującego egzony 4 i 5 pokazuje, że wykrywalny transkrypt jest nieobecny. IRES oznacza wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu, gen beta-galaktozydazy B-Gal, promotor MC MC, gen oporności na neomycynę i ekson Ex. Transgeniczne myszy (Gpr54tm1PTL) utrzymywano jako wsobne wsady na tle genetycznym 129S6 / SvEv. Strategia nakierowania na gen opracowała delecję zarodkowych pętli i 2 w linii zarodkowej oraz domen obejmujących (Figura 2A). Prawidłowe ukierunkowanie zostało zweryfikowane dla ramion 3 i 5 metodą Southern blotting i PCR (Figura 2B). Wytwarzanie zerowego allela Gpr54 potwierdzono za pomocą RT-PCR (Figura 2C). Genotypowanie przeprowadzono metodą PCR (patrz Dodatek Dodatek 2, dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie http://www.nejm.org). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono pod nadzorem brytyjskiej licencji Home Office Project i zostały zatwierdzone przez lokalny zespół ds. Etyki.
Wstrzyknięcie hormonu uwalniającego gonadotropinę
Samice myszy typu dzikiego były wystawiane przy użyciu rozmazów pochwowych. Samice myszy typu dzikiego w diestrus i samice Gpr54 – / – otrzymały cztery dootrzewnowe iniekcje 25 ng hormonu uwalniającego gonadotropinę (Sigma) w 30-minutowych odstępach.15 Myszy zabito 30 minut po ostatnim wstrzyknięciu. Próbki krwi i próbki przysadki traktowano jak opisano wcześniej, z wyjątkiem tego, że próbki przysadki homogenizowano w 0,3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
Testy hormonalne
Czułość testu immunoradiometrycznego dla hormonu luteinizującego wynosiła 0,07 ng na mililitr (zmiana w skali testu, 6,0 procent, zmiana między testami, 12,5 procent), a czułość testu radioimmunologicznego dla hormonu folikulotropowego wynosiła 2 ng na mililitr (zmiana w skali testu, 10 procent , różnica między testami, 18 procent). Hormon uwalniający gonadotropinę mierzono za pomocą testu radioimmunologicznego, 16 z granicą wykrywalności wynoszącą 0,2 .g na probówkę (0,83 .g na mililitr) i zmianą w teście śróddziennym 13 procent. Testosteron mierzono za pomocą testu radioimmunologicznego z czułością 0,2 nmola na litr (zmiana testowa, 6,0%, zmienność między testami, 18%). 17.-estradiol mierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), o czułości 10 .g na mililitr (zmiana wewnątrz-testowa, 3,9%, zmiana między testami, 10%).
Badania histologiczne
Tkanki myszy wycięto i utrwalono na 4 godziny w 4% formaldehydzie, a następnie przemyto trzy razy w 0,01 procentowym roztworze soli buforowanej fosforanem.
[podobne: przychodnia na żelaznej, spłycenie lordozy, otręby ryżowe ]
[więcej w: sennik kłótnia z siostrą, spłycenie lordozy, przychodnia bonifratrów ]