Gen GPR54 jako regulator okresu dojrzewania cd

Do porównania genotypów i fenotypów wybrano sześciu pacjentów z hipogonadyzmem hipogonadyzmu normosfizycznego, którzy brali udział w badaniach odpowiedzi na dawkę egzogennego, pulsacyjnego hormonu uwalniającego gonadotropiny i którzy byli negatywni w stosunku do mutacji GPR54 w badaniu genomowym. Klonowanie specyficzne dla alleli
W celu wykazania zmian w parach zasad na oddzielnych allelach, specyficzne produkty PCR klonowano w wektorze plazmidowym pCRII-TOPO (Invitrogen). Kolonie hodowano i sekwencjonowano ich DNA.
PCR odwrotnej transkryptazy
Pacjenci, u których zidentyfikowano zmiany w sekwencji kodującej w GPR54, byli dalej badani za pomocą odwrotnej transkryptazy (RT) -PCR, aby wykluczyć tajne zdarzenia składania. Całkowity RNA ekstrahowano z limfoblastoidalnych linii komórkowych, a cDNA GPR54 amplifikowano i sekwencjonowano.
Generowanie zmutowanych konstrukcji
Sekwencję ssaczego wektora ekspresyjnego pCMVsport 6 zawierającego pełnej długości GPR54 typu dzikiego (klon CS0DE005YC17, Invitrogen) potwierdzono przez bezpośrednie sekwencjonowanie i stwierdzono, że zawiera ogon poliA. Przeprowadzono mutagenezę ukierunkowaną w celu wprowadzenia trzech mutacji (L148S, R331X i X399R) do tego wektora. Ponadto kodon stop wprowadzono bezpośrednio po ogonie poliA (konstrukt nazwano X399R polyA stop ).
Badania nad sygnalizacją GPR54
Naturalny ligand dla GPR54, kisspeptyny-1 (kodowanej przez gen KISS1), został zidentyfikowany przez trzy oddzielne grupy.8-10 Wykazano, że jego C-końcowy dekapeptyd kisspeptyna-1 112-1219 był peptydem o minimalnej długości wymaganym dla pełna stymulacja GPR54 (klasa Gq białek G sprzężona z fosfolipazą C). Stymulacja GPR54 przez kisspeptynę-112-121 zwiększa obroty fosfatydyloinozytolu.
Komórki nerki (COS-7) z afrykańskich zielonych małp przejściowo transfekowano 1,5 .g każdego konstruktu GPR54 lub pustego wektora (pCMVsport6) na studzienkę, stymulowano różnymi dawkami kisspeptyny-1 112-121 przez 45 minut, a następnie ekstrahowano. z 20 mM kwasu mrówkowego. Supernatanty naniesiono na kolumny anionowymienne i wyekstrahowano fosforany inozytolu. 11 Testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach.
Ilościowy RT-PCR
Ilościowy RT-PCR przeprowadzono na RNA wyizolowanym z unieśmiertelnionych limfoblastów otrzymanych od pacjentów (TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix, Applied Biosystems). Zastosowano różne startery i sondy zdolne do specyficznego wzmacniania alleli R331X i X399R. Próbki prowadzono w czterech powtórzeniach w co najmniej dwóch niezależnych eksperymentach. Gen .-aktyny został użyty jako endogenna kontrola w celu standaryzacji testów pod względem poziomów ekspresji.
Korelacje genotyp-fenotyp
Pacjent niosący mutacje R331X i X399R został przyjęty do Ogólnego Ośrodka Badań Klinicznych w Szpitalu Ogólnym w Massachusetts. Pobieranie krwi wykonywano co 10 minut przez 12 godzin. Pacjent otrzymał hormon uwalniający gonadotropinę podskórnie co dwie godziny, a jego dawkę miareczkowano, gdy był ambulato- rem, aż do momentu, gdy jego oś przysadkowo-gonadalna uległa normalizacji. Po 11 miesiącach leczenia pacjent poddano badaniu zależności odpowiedzi od dawki, w którym cztery dawki hormonu uwalniającego gonadotropiny obejmujące 1,5 logarytmiczne rzędy (7,5-250 ng na kilogram masy ciała na bolusa) podano dożylnie w losowej kolejności, a hormon luteinizujący często pobierano próbki.12 Pulsywne wydzielanie hormonów oceniano za pomocą zmodyfikowanej wersji metody Santena i Bardina 13,14
Badania na myszach
Rysunek 2
[patrz też: zestaw diagnostyczny stomatologiczny, wyszukiwarka leków, otręby ryżowe ]
[patrz też: obst oborniki, peroksydaza glutationowa, larmed kraków ]