Gen GPR54 jako regulator okresu dojrzewania ad 6

Analiza sekwencji tych produktów wykazała, że nowo zidentyfikowane mutacje nie spowodowały składania w formie splotu kryptycznego (dane nie pokazane). Testy funkcjonalne
Figura 3. Figura 3. Krzywe dawka-odpowiedź dla stymulowanej ligandem produkcji fosforanu inozytolu w zmutowanych konstruktach, skorygowanych o zawartość białka. Punkty danych reprezentują średnie wielokrotne powtórzenia, każde zmierzone trzykrotnie. Kotransfekcja beta-galaktozydazą nie wykazała różnic w skuteczności transfekcji; ilościowy RT-PCR i Western blot ujawniły równoważny ekspresję transkryptu i białka (dane nie pokazane). Panel A pokazuje krzywą dla mutacji L148S (trzy niezależne eksperymenty, każdy wykonany w trzech powtórzeniach), panel B krzywą dla mutacji R331X (dwa niezależne eksperymenty, każdy wykonany w trzech powtórzeniach), a panel C krzywą dla mutacji poliA stop X399R (dwa niezależne eksperymenty, każdy przeprowadzony w trzech powtórzeniach); procenty na osi y reprezentują wartości procentowe maksymalnej stymulacji dla każdego konstruktu GPR54. Panel D pokazuje względną kwantyfikację dzikiego typu i zmutowanej ekspresji allelu GPR54 w limfoblastoidalnych liniach komórkowych mierzonych za pomocą ilościowego RT-PCR. I słupki reprezentują standardowe błędy.
Aby określić, czy zidentyfikowane zmiany w GPR54 wpływają na działanie receptora, wytwarzanie fosforanu inozytolu mierzono w komórkach COS-7 w odpowiedzi na kisspeptynę-1 112-121. Maksymalna odpowiedź fosforanu inozytolu komórek transfekowanych zmutowanymi konstruktami L148S i R331X została zmniejszona odpowiednio o 65 procent i 67 procent, w porównaniu z komórkami, które transfekowano genem typu dzikiego (Figura 3A i Figura 3B). . RT-PCR komórek COS-7 transfekowanych konstruktem X399R ujawnił transkrypt, który zawierał region 3 nieulegający translacji, ogon poliA i sekwencję wektora ekspresyjnego (dane nie pokazane). W nieobecności fizjologicznego kodonu stop w pozycji 399 (ale z kodonem stop w sekwencji wektora), transkrypt in vitro dawał wydłużone białko receptorowe. Ponieważ ten konstrukt in vitro nie naśladował dokładnie fizjologii in vivo, nie był stosowany w badaniach funkcjonalnych. Konstrukt XA99R z poliA stopu, który sprawia, że białko jest identyczne z białkiem kodowanym przez nonstop transkrypt, stymuluje wytwarzanie fosforanu inozytolu, które stanowi 61 procent dzikiego GPR54 (Figura 3C). W przypadku pCMVsport 6 nie zaobserwowano stymulacji fosforanem inozytolu.
Ilościowy RT-PCR
Analizę ekspresji alleli GPR54 przeprowadzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, z zastosowaniem jako matrycy matrycowego RNA (mRNA) limfoblastycznego. Zmutowane allele eksprymowano w stężeniach skorelowanych ze stężeniami kontrolnych limfoblastów. W porównaniu ze standardowym kontrolnym mRNA, średnie (. SE) całkowite stężenie mRNA GPR54 u pacjenta heterozygotycznego związku wynosiło 17,6 . 1,6% normalnego stężenia (P <0,001 według t-Studenta); Stężenie ekspresji allelu R331X wynosiło 17,9 . 1,9% normalnego stężenia, a stężenie ekspresji allelu X399R wynosiło 2,5 . 0,3% normalnego stężenia (Figura 3D).
Fenotypowanie endokrynologiczne
Rysunek 4
[hasła pokrewne: wyszukiwarka leków, zaburzenia integracji sensorycznej u dzieci, korona cyrkonowa ]
[hasła pokrewne: półpasiec ile trwa, rvg, biofazolin ]